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本制品以DiI的高氯酸盐形式提供。DiI,DiO,DiD和DiR作为一类长链的亲脂性二烷基碳菁类染料（Dialkylcarbocyanines）荧光染料家族，用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。作为一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子（例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱）结合时，其荧光强度显著增强。一旦进入细胞后，它们在细胞内质膜中逐步扩散，于最佳浓度条件下可将整个细胞均匀染色。这些染料具很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。

四种染料呈现不同的荧光颜色，DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光），为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。DiO和DiI分别用标准FITC和TRITC滤光器检测，可结合使用。其中，DiI及其衍生物由于极其低的细胞毒性，应用最为广泛。不仅普遍用于活体和固定组织及细胞的神经元逆行性和顺行性示踪分析，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程的细胞迁移，通过FRAP（荧光光漂白恢复技术）检测脂质在细胞膜上的扩散过程，检测细胞毒性，以及标记脂蛋白如LDL和HDL等。

英文名称：1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
CAS号：41085-99-8
分子式：C₅₉H₉₇ClN₂O₄
分子量：933.87g/mol
纯度：≥98%（TLC）
溶解性：溶于DMF，DMSO，甲醇
外观：红色至暗红色，紫色至深紫色粉末
Ex/Em：550/567nm（inphosphate buffer/SDS pH7.0）
推荐滤光器：Omega-XF108,XF32,Chroma-41002,31002
结构式：
    
保存：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

• 经碳菁类染料染色后的细胞能用多聚甲醛(PFA)固定，但不能用甲醇或其他溶剂的固定剂。染色能承受0.1% Triton X-100或0.1%毛地黄皂苷的透化处理，但会明显增强胞内染色。
  
• 经碳菁类染料染色后的细胞不建议使用封片剂，因封片剂内的甘油或有机溶剂会溶解染料，引起增加的胞内染色和随时间增加的高背景。建议直接在PBS或其他生理缓冲液内成像。使用PBS直接盖上盖玻片，然后四周用指甲油密封。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

注意：以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

一、染色液制备

• 储存液制备
  用DMSO或乙醇配置浓度1～5mM的储存液。例如，取5mg DiI（Mw：933.87g/mol）溶于1.07mL无水DMSO中，充分溶解，即得到5mM的储存液。
  注意：未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融。
  
• 工作液制备
  用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，调整到1～5μM的工作浓度。
  注意：工作液最终浓度需要根据不同细胞系和实验体系来优化。建议从推荐浓度开始，以10倍范围为区间进行最优浓度的摸索。

二、悬浮细胞染色

• 加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×10⁶/mL。
  
• 37℃孵育细胞2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化以保证得到均一化的标记结果。
  
• 孵育结束，按1000～1500rpm离心5min。
  
• 去除上清液，之后轻柔加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。
  
• 再重复3、4步骤两次。

三、贴壁细胞染色

• 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
  
• 从培养基中移走盖玻片，滤掉过量培养液，将盖玻片放在潮湿的小室内。
  
• 在盖玻片的一角加入100μL的染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
  
• 37℃孵育细胞2～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化以保证得到均一化的标记结果。
  
• 吸掉染色工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10min，然后吸走培养基。

四、显微镜检测

• DiD，DiO，DiI，DiR滤光器的选择参见下表：
  

  荧光探针	Ex/Em	Omeaga公司	Chroma公司
  DiI	549/565nm	XF108,XF32	41002,31002
  DiO	484/501nm	XF100,XF2341001,31001	41001,31001
  DiD	644/665nm	XF110,XF47	41008,31023
  DiR	750/780nm	XF112	41009

  
  
• 多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：
  ① DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；
  ② DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；
  ③ DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005。

五、流式细胞仪检测
经DiO，DiI，DiD和DiR染色的细胞分别用流式细胞仪的FL1，FL2，FL3或FL4通道检测。

• 我的实验需要观察几小时的活细胞形态变形（deformation），哪种膜探针能满足此要求？
  亲脂的碳菁类染料DiI,DiO,DiD和DiR通常都能满足此要求。染料的烷基链越长，在脂质环境内的停留性越好。
  
• 我的实验先用亲脂碳菁类染料比如DiI染色，当后续进行抗体标记后信号丢失，为什么？
  由于此类染料插入脂膜内，任何破话膜结构都会引起染料丧失。这些步骤包括用表面活性剂(比如Triton X-100)进行透化，或有机溶解比如甲醇。对于胞内抗体的标记进行透化是必不可少的，必然会引起染料的丢失。反而选择反应性染料CFDA SE，能与胞内组分进行共价结合，进而经固定和透化处理后能呈现更好的停留性。
  
• 我的实验用DiI标记神经元，之后进行固定和透化，结果没信号，什么原因？
  DiI是亲脂染料，基本停留在细胞脂质内。当细胞表面活性剂进行透化或用醇类进行固定，都会将脂质和染料洗脱掉。如果必须要进行透化，可选择CM-DiI，因其实共价结合到膜内蛋白上。可能经固定和透化后部分信号丧失，但有足够的信号保留下来使得能检测到。

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